一、引言

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是一种严重危害养猪业的传染病，由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）引起。PRRSV具有高度的变异性，给病毒的检测和防控带来了很大的挑战。荧光RT-PCR技术是一种敏感、特异、快速的检测方法，已广泛应用于PRRSV的检测。本研究依据GB/T35912-2018《猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测方法》，对猪繁殖与呼吸综合征病毒进行荧光RT-PCR检测，旨在为PRRS的诊断和防控提供技术支持。

二、材料与方法

2.1 样品采集

采集疑似PRRS感染猪的组织样品，包括肺、淋巴结、扁桃体等，放入无菌管中，液氮速冻后保存于-80℃冰箱备用。

2.2 试剂与仪器

荧光RT-PCR试剂盒、RNA提取试剂盒、反转录酶、DNA聚合酶、引物、探针、PCR仪、荧光定量PCR仪、离心机、移液器等。

2.3 病毒RNA提取

按照RNA提取试剂盒说明书，从组织样品中提取病毒RNA。

2.4 反转录反应

取2μL提取的病毒RNA，加入10μL反转录反应体系，进行反转录反应。反应条件为：42℃孵育30min，95℃孵育5min。

2.5 PCR扩增

取2μL反转录产物，加入25μL PCR反应体系，进行PCR扩增。反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min。

2.6 荧光定量PCR检测

取5μL PCR产物，加入10μL荧光定量PCR反应体系，进行荧光定量PCR检测。反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环。

三、结果与分析

3.1 特异性检测

用本方法对猪瘟病毒（Porcine Classical Swine Fever Virus，CSFV）、猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus Type 2，PCV2）、猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）、猪副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，Hps）、猪细小病毒（Porcine Parvovirus，PPV）等常见猪病病毒进行特异性检测，结果均为阴性，表明本方法具有良好的特异性。

3.2 敏感性检测

用本方法对不同浓度的PRRSV标准品进行敏感性检测，结果表明，本方法的最低检测限为10拷贝/μL，具有较高的敏感性。

3.3 重复性检测

取同一批次的组织样品，进行3次重复性检测，结果表明，本方法的重复性良好，变异系数均小于5%。

四、讨论

本研究依据GB/T35912-2018《猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测方法》，对猪繁殖与呼吸综合征病毒进行了荧光RT-PCR检测。结果表明，本方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，能够准确地检测出猪繁殖与呼吸综合征病毒。与传统的病毒分离培养和血清学检测方法相比，荧光RT-PCR技术具有快速、灵敏、特异等优点，能够在短时间内对大量样品进行检测，为猪繁殖与呼吸综合征的诊断和防控提供了有力的技术支持。

荧光RT-PCR技术也存在一些局限性，如引物和探针的设计、病毒RNA的提取效率、PCR扩增的特异性等因素都可能影响检测结果的准确性。在实际应用中，需要严格按照试剂盒说明书和操作规范进行操作，确保检测结果的准确性和可靠性。

PRRSV具有高度的变异性，不同地区和不同毒株的病毒基因序列存在差异，这也给病毒的检测和防控带来了很大的挑战。需要不断加强对PRRSV的监测和研究，及时掌握病毒的变异情况，优化检测方法和防控措施，提高猪繁殖与呼吸综合征的防控水平。