一、引言

番茄黑环病毒（Tomato black ring virus，TBRV）是一种重要的植物病毒，可引起番茄严重的病害，导致产量损失和品质下降。为了有效控制TBRV的传播和危害，准确的检疫鉴定方法至关重要。本文将依据GB/T31795-2015《番茄黑环病毒检疫鉴定方法》，详细介绍该方法的操作步骤和要点。

二、样本采集

根据GB/T31795-2015，样本应从疑似感染TBRV的番茄植株上采集。采集时应选择具有典型症状的植株部位，如叶片、茎尖等。采集的样本应立即放入无菌容器中，并标记好样品信息，包括采集地点、采集时间、植株编号等。

三、病毒提取

病毒提取是TBRV检疫鉴定的关键步骤之一。根据GB/T31795-2015，可采用以下方法进行病毒提取：

1. 研磨法：将采集的样本放入研钵中，加入适量的提取缓冲液，研磨成匀浆。然后将匀浆转移至离心管中，离心收集上清液。

2. PEG沉淀法：将研磨后的样本上清液加入等体积的PEG-6000溶液，轻轻混合均匀。然后在4℃下离心，收集沉淀。

3. 过滤法：将PEG沉淀后的上清液通过0.45μm的滤膜过滤，去除杂质。

四、核酸提取

核酸提取是TBRV检疫鉴定的核心步骤之一。根据GB/T31795-2015，可采用以下方法进行核酸提取：

1. 酚氯仿法：将过滤后的上清液加入等体积的酚氯仿溶液，轻轻混合均匀。然后在室温下离心，收集上清液。将上清液转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻混合均匀。然后在室温下离心，收集沉淀。将沉淀用70%的乙醇洗涤两次，晾干后溶解于适量的TE缓冲液中。

2. 磁珠法：将过滤后的上清液加入磁珠结合液中，轻轻混合均匀。然后将混合液转移至磁力架上，静置片刻，使磁珠吸附在磁力架上。弃去上清液，将磁珠用洗涤液洗涤两次，晾干后溶解于适量的TE缓冲液中。

五、PCR扩增

PCR扩增是TBRV检疫鉴定的常用方法之一。根据GB/T31795-2015，可采用以下引物进行PCR扩增：

1. 上游引物：5'-GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT GCT